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浅谈ELISA
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。实验原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。样本采集 ELISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA很简单，其实不然。ELISA实验在操作的过程中还是有很多细节需要大家注意的。所有标本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。 细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。 血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在3天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清样本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作。标本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保标本均匀充分解冻。操作步骤 ELISA在操作前试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。 设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 温育好后揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。 洗板好后将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。 检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。
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HBV是引起乙型肝炎（简称乙肝）的病原体，属嗜肝DNA病毒科，该科病毒包含正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝DNA病毒属。HBV感染是全球性的公共卫生问题，随着基因工程疫苗的生产和投入，乙肝疫苗的普及率逐年上升，感染率呈下降趋势。（艾恩斯生物现货供应乙肝病毒系列ELISA试剂盒产品，详见：http://www.inselisa.com/web/goods/list/97）） 破坏肝脏的乙型肝炎病毒（HBV）每年导致近100万人死亡。现在，两项新的遗传研究表明，至少从人类文明的发源阶段开始，这种病原体就已经伴随在我们左右了。 迄今为止，HBV最古老的证据是在16世纪的意大利木乃伊身上发现的一种菌株。而在其中一项新研究中，由英国剑桥大学遗传学家Eske Willerslev领导的研究小组，对在遍布整个欧亚大陆的考古遗址中发现的304个个体的完整基因组进行了测序，其中大多数都来自于青铜时代和铁器时代（大约公元前3500年到公元前500年）。 研究人员很快就在12个个体中发现了HBV的基因特征。其中最古老的样本——来自一名男性——大约有4500年的历史，是在德国奥斯特霍芬市的一个古老坟墓中发现的。 随后，研究小组将这些古老病毒的脱氧核糖核酸（DNA）序列与现代版本的HBV进行了比较，并使用先进的数学建模技术，结合它们在人群中的流行程度，估算了这些变异的产生时间。 数据显示，这些病毒可能起源于大约公元前13600年至公元前9600年之间。研究人员在5月9日出版的《自然》杂志上报告了这一研究成果。 而另一项由德国耶拿市马克斯·普朗克学会人类历史科学研究所遗传学家Johannes Krause主持的研究，在该国发现的3具骨骼遗骸的牙髓中发现了HBV的痕迹，其年代可以追溯到公元前5000年到公元前3200年。 考虑到这两项研究的结果，“HBV似乎在过去很常见”，Krause说，他的团队在上周早些时候发表在bioRxiv预印服务器的一篇论文中报告了这项研究工作。Krause认为，这并不一定是一个惊喜，但它为研究人员未来研究其他古代疾病指明了方向。 有一种流行的假设是，基于黑猩猩和大猩猩的HBV菌株与人类极为相似的事实，这种病毒很可能最早出现于非洲，然后在狩猎或割肉的过程中通过血液与血液的接触进入人体。从那时开始，随着人类在距今12万年到8万年前进入欧亚大陆，这种病毒可能会扩散到不同的菌株之中。 而Willerslev的研究小组的发现提出了一种有趣的替代可能性，即HBV可能是“最近”才出现在生活在欧亚大陆甚至北美的人类身上，然后在非洲被传播给人类和非人类灵长类动物，尽管这样的传播机制依然是模糊的。 这一时间表与人类文明的开端相吻合，因为人口和贸易路线的扩大将有助于疾病的传播，并转化为新的菌株。 然而Krause对这种病毒何时出现的估计结果持怀疑态度。他说，HBV将来自其宿主的遗传物质重新组合，因此典型的基于基因突变比率的分子年代测定技术并不起作用。 没有参与这项研究的加拿大汉密尔顿市麦克马斯特大学进化遗传学家Hendrik Poinar也认为，鉴于目前的数据，这些限制使得人们很难推测病毒的起源年代。Poinar表示：“在这一点上，关于HBV起源时间的任何说法都是不确定的。” 但是Poinar指出，不管HBV的年龄如何，“这些论文非常漂亮地展示了，你可以在几千年前的DNA中找到病原体的样本”。“这种病毒与人类的互动是一种持续了数千年的动态。”
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艾恩斯生物新品上新：肿瘤标志物类试剂盒 什么是肿瘤标志物？ 肿瘤标志物又称肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到。 艾恩斯生物最新上新一系列的肿瘤标志物类试剂盒，此类试剂盒应用方法为ELISA，仅供科研使用，不得用于临床检验！ 新品列表如下：（点击产品可查看详情）癌胚抗原(CEA)定量检测试剂盒（ELISA）卵巢癌抗原（CA125）定量检测试剂盒（ELISA）组织多肽抗原（TPA）定量检测试剂盒（ELISA）鳞状细胞癌相关抗原（SCC)定量检测试剂盒（ELISA）乳腺癌标志物-CA153（CA153）定量检测试剂盒（ELISA）神经元特异性烯醇化酶（NSE）定量检测试剂盒（ELISA）胃肠癌标志物CA199（CA199）定量检测试剂盒（ELISA）胰腺癌标志物-CA242（CA242）定量检测试剂盒（ELISA）P53蛋白（P53）定量检测试剂盒（ELISA）甲胎蛋白（AFP）定量检测试剂盒（ELISA）肿瘤标志物（CA724）定量检测试剂盒（ELISA）细胞角蛋白19（CK19）定量检测试剂盒（ELISA）细胞角蛋白21-1片段（CYFRA21-1）定量检测试剂盒（ELISA）高尔基体蛋白73（GP73）定量检测试剂盒（ELISA）内皮细胞特异性分子（Endocan;ESM-1）定量检测试剂盒（ELISA） 艾恩斯生物作为科研试剂盒生产厂家，所有产品均自主研发生产，进口抗体做原材料，质量保证，操作简便，数据精准，价格合理，现货供应，全程技术支持，免费代测，顺丰包邮，助力您的科研实验。 更多新品陆续上新中，欢迎咨询！！
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